Estandarización de pruebas de elisa tipo indirecto para la determinación de los niveles de anticuerpos igg e ige anti-leishmania, como método complementario para el diagnóstico de la enfermedad
Resumen
La leishmaniasis cutánea es una enfermedad caracterizada por la inducción de una respuesta tipo Th2 caracterizada por la producción de respuesta inmune humoral, siendo los niveles de anticuerpos IgG e IgE indicadores de diagnóstico, progresión y resolución de la infección. En el presente estudio se han estandarizado dos técnicas de ELISA tipo indirecto, para determinar los niveles de anticuerpos IgG e IgE contra antígeno soluble de Leishmania braziliensis. Para determinar los niveles de anticuerpos IgG e IgE-anti-Leishmania se obtuvo antígeno soluble de Leishmania (ASL) de promastigotes de L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) en fase estacionaria de crecimiento por sonicación directa y centrifugación a 6800 rpm/15min, obteniendo una concentración ideal para tapizar los micropozos Greiner bio-one (CELLSTAR®) de g/ml para el ELISA IgG y 20 g/ml para el ELISA IgE en tampón carbonatos 0.1 M pH 9.6 por 18 horas/4ºC. El exceso de sitios reactivos fue bloqueado con PBS-BSA 0,1por ciento por 1 hora/temperatura ambiente; la dilución del suero utilizada fue de 1/21 en tampón fosfatos 0,01 M, pH 7.4 para ambos casos. En el caso del ELISA IgE, se hizo un pre-tratamiento del suero con 25 l de una solución de anticuerpos anti-IgG humano a una dilución de 1/500 en solución salina fisiológica y 60 l de polietilenglicol al 12,5 por ciento (PEG) se mezcló bien y se dejó en incubación por 30 minutos a 37 ºC, se centrifugaron los tubos a 3500 rpm/15min y se trabajó con el sobrenadante; la dilución del conjugado (anticuerpos monoclonales anti-IgG; anti-IgE humano conjugados con peroxidasa) fue 1/500 para el ELISA IgG y 1/100 para el ELISA IgE en PBS-Tween 20 0,05por ciento - BSA 0,1 por ciento en ambos casos se utilizó O-fenildiamina como sustrato a 2,2 mg/ml en tampón citrato-fosfato 0,05 M pH 5, se utilizó H2SO4 3N como solución de parada, la absorbancia fue leída a 490-630 nm en un lector de ELISA (Bio-teck Instruments Inc, USA). Las densidades ópticas del ELISA IgG estandarizado fueron (?DO ± DS)=1,154 ± 0,240 para los controles positivos y 0,227 ± 0,013 para los negativos, con un coeficiente de variación CV de 0,208 y 0,057 (P[0,05) respectivamente, la línea de corte fue = 0,276. La eliminación del IgG interferente con PEG 12,5por ciento redujo un 61,93por ciento la DO para los controles positivos y en 32por ciento para los negativos. El ELISA IgE estandarizado tuvo DO (?DO ± DS) 0,434 ± 0,018 para los controles positivos y 0,089 ± 0,005 para los negativos, con coeficiente de variación CV de 0,041 y 0,056 (P[0,05) respectivamente, la línea de corte fue =0,173. En el ELISA IgG se tuvo un 100por ciento de correlación de resultados positivos (S = 100por ciento) y negativos (E = 100por ciento) frente a un ELISA comercial r-Biopharm®, con un índice de correlación de Kappa de 1 (p[ 0,05), que equivale a una muy buena correlación de resultados entre los dos métodos en estudio. Los resultados obtenidos de la estandarización de ambas técnicas de ELISA, muestran que pueden ser utilizados como herramienta de diagnóstico y seguimiento terapéutico de los pacientes con leishmaniasis. Sin embargo es necesario continuar con los estudios para validar estos procedimientos y determinar las posibles reacciones cruzadas que puedan tener ambos ELISAs.