Estandarización del método de inmunodifusión radial para la determinación de la actividad hemolítica total del complemento.

Abstract

El sistema del complemento es un complejo constituido por más de 30 proteínas plasmáticas y de membrana, en el cual la activación enzimática secuencial de sus componentes genera una cascada biológica que permite que se puedan cumplir diferentes funciones. En el presente trabajo se ha estandarizado una técnica que permite medir la actividad hemolítica total del complemento por Inmunodifusión radial, la misma que reduce costos, tiempo y material, de la cual los valores obtenidos se los relaciona con el método de ELISA que determina la actividad hemolítica total del complemento (estándar de oro) y la técnica de dilución en tubos de uso rutinario en el Laboratorio de Histocompatibilidad e Inmunogenética del Instituto SELADIS. En el proceso de estandarización se evaluó el título óptimo de la hemolisina para la sensibilización de los glóbulos rojos, las condiciones de preparación del gel de agarosa que contiene los glóbulos rojos sensibilizados, se determinó los puntos de corte para establecer niveles altos y bajos de la actividad del complemento y se determinó la sensibilidad y especificidad diagnóstica de la prueba estandarizada. Con los resultados obtenidos, se determinó que el ajuste de concentración celular de los glóbulos rojos de carnero debe realizarse por espectrofotometría a la densidad óptica de 0.500 leído a una longitud de onda de 540 nm, la hemolisina debe ser diluida 1/150. Estos parámetros producían resultados con mejor repetitividad y reproducibilidad. En pacientes sin enfermedad los valores de referencia se encuentran en el rango de 8.34 y 5.58 mm de diámetro con un valor promedio de 6,96 mm. Los pacientes con actividad hemolítica total del complemento (CH100) disminuida, mostraron un valor promedio de 4.10 mm con límites superior de 4,83 mm de diámetro. Estos hallazgos nos muestran que la zona de duda “área gris” para el método estandarizado estaría comprendida entre los valores de 4.84 a 5,57 milímetros de diámetro. Se determinó que la técnica de Inmunodifusión radial (IDR) y dilución en tubos tienen una Sensibilidad de 88% y Especificidad de 73 % y una Sensibilidad de 75% y Especificidad del 65% respectivamente en correlación a la técnica de ELISA (p < 0.005). Finalmente los coeficientes de variación (p < 0.005) de los ensayos de repetitividad y reproducibilidad de la prueba de IDR fueron 4,8% y 4,9% respectivamente. Con los resultados obtenidos del presente estudio se determinó que la prueba de IDR estandarizada es un método alternativo para determinar los niveles de CH100 de los pacientes por poseer mayor sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y repetitividad que el método de dilución en tubos que se utiliza de manera rutinaria en el laboratorio.