Extracción de DNA de Leishmania sp. para el diagnóstico de leishmaniasis cutánea por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a partir de frotis de lesión teñidos con giemsa.

Abstract

En Leishmaniasis la patogenicidad, abordaje terapéutico y los posibles métodos de control son determinados en gran parte, por la especie de Leishmania infectante; por lo tanto, es importante que en cualquier caso de leishmaniasis, este sea identificado. Continuamente se van proponiendo nuevas estrategias o métodos en el diagnóstico de la leishmaniasis, para lo cual surge como propuesta efectiva la combinación de técnicas, como el Examen parasitológico directo con el diagnóstico molecular por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). En el presente trabajo se propone estandarizar y validar un procedimiento de extracción de DNA de Leishmania a partir de frotis teñidos con Giemsa como una nueva alternativa para mejorar el diagnóstico y seguimiento molecular de esta patología. Los procedimientos utilizados para alcanzar los objetivos incluyeron varios pasos: El cultivo celular de parásitos de L. braziliensis, la preparación de frotis a partir de suspensiones de parásitos con sangre anticoagulada a los cuales posteriormente se realizó la tinción con colorante Giemsa y la extracción de material genético mediante tres protocolos de extracción de DNA a evaluar: Solución de lisis con Proteinasa K (SLPK), Boiling y Kit Comercial Wizard Genomic; toma de muestra de frotis de lesión de pacientes, realizando luego la tinción con colorante Giemsa y el Examen parasitológico directo; extracción de DNA a partir de los frotis de lesión teñidos mediante el método de SLPK, el material genético obtenido fue utilizado para la PCR cuyos resultados mediante un test diagnóstico fueron comparados con los exámenes de laboratorio de rutina utilizados para el diagnóstico de leishmaniasis (PCR convencional y Examen parasitológico directo); los datos obtenidos fueron utilizados para los cálculos estadísticos para la determinación de la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y grado de correlación por el método de SLPK frente al Examen parasitológico directo y PCR convencional. En la etapa de estandarización de los tres protocolos de extracción de DNA, el método de SLPK presentó el mejor rendimiento de los tres métodos evaluados con concentraciones de DNA en el rango de 19,77 a 38,18 ng/uL y con índices de pureza de DNA en el rango de 1,037 a 1,046. Con los resultados de la PCR, el método SLPK presenta una sensibilidad diagnóstica de 93%, especificidad de 45%, valor predictivo positivo de 68% y valor predictivo negativo de 84%. El grado de correlación según el índice de Kappa del método SLPK frente al frotis fue Moderada de 0,403 (p< 0,005) y entre los dos métodos de PCR la correlación fue Buena con índice de Kappa de 0,700 (p< 0,005). Estos resultados demuestran que el método SLPK es una buena alternativa al diagnóstico de leishmaniasis, ya que puede detectar la presencia del parásito en pacientes con carga parasitaria baja en los que el Examen parasitológico directo daría resultados falsos negativos, y que sería una herramienta útil no solo para el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad sino también para determinar polimorfismos genéticos e identificación de especies del parásito si se utilizan frotis históricos de pacientes.