Estudio comparativo de tres métodos de procesamiento para la obtención de ADN en dientes molares

Abstract

Estudios genéticos en restos óseos hoy en día son más frecuentes a pesar del limitado rendimiento de ADN obtenido en muestras pobremente conservadas que son de interés forense y antropológico. Con la finalidad obtener ADN nuclear de utilidad en casos forenses este estudio presenta tres métodos de procesamiento de dientes molares los cuales son a) pulverización del diente con nitrógeno líquido, b) pulverización específica del diente en diferentes tejidos que son la pulpa, el cemento y la dentina, c) desmineralización total del diente con EDTA 0.5M. Para evaluar la diferencia del rendimiento de los métodos se trabajó con tres tipos de diente 1) dientes molares intactos, 2) dientes molares enterrados, 3) dientes molares cariados. La extracción del ADN se lo realizó con el kit comercial QIAamp DNA Investigator (QIAGEN), la cuantificación con el equipo fluorométrico Qubit 3.0 y el kit de ensayo dsDNA HS Qubit. Además, se utilizó el método semi-cuantitativo por electroforesis en gel de agarosa al 1% para evaluar la intensidad de ADN. Se realizó la amplificación de los sitios sexuales cortos en la región SRY (cromosoma Y) y DXZ4 (cromosoma X) a través de una PCR anidada multiplex cuyos productos finales generaron amplicones internos del tamaño de 204-bp y 91-bp que fueron visualizados en gel de agarosa al 1.7%. Posteriormente seleccionamos 6 muestras para la tipificación de STRs con el kit AmpFlSTR® Identifiler® (Applied Biosystems) los datos recolectados en el analizador genético 3130 (Applied Biosystems) fueron analizados con el programa informático GeneMapper ID v3.2.1. Los resultados mostraron que el diente es un buen recurso en cuanto a material genético ya que se obtuvieron concentraciones de ADN cuantificable desde 0,0692 a 18.4 ng/ul. En los dientes intactos se pudo identificar sexualmente a todos los individuos en todos los métodos de procesamiento y se obtuvieron perfiles STRs completos con el método de pulverización total y pulverización especifico en el tejido pulpar y un perfil parcial en una muestra procesada por desmineralización total. En muestras enterradas no se pudo obtener perfiles STRs con ningún método y se tuvo exigir la PCR anidada para tener éxito en la determinación del sexo en todas las muestras enterradas. En dientes cariados se pudo determinar exitosamente el sexo de todos los donantes y obtuvimos excelentes resultados en el pulverizado específico de la dentina en cuanto a cantidad (7,28 ng/ul promedio de ADN) y calidad ya que se obtuvo el perfil completo STR a partir del ADN obtenido en este tejido.