Procedimientos moleculares para la identificacion y tipificacion del Virus del Papiloma Humano en cancer cervico uterino y lesiones intraepiteliales precursoras.

Abstract

El cáncer de cuello uterino es una enfermedad neoplásica maligna de cérvix y cuya progresión final conduce a la muerte. En el mundo entero representa el cáncer más común, después del cáncer de mama, en los países en vías de desarrollo representa el principal problema de salud pública atribuible a cáncer que afecta a la población femenina. En Bolivia el cáncer de cuello uterino tiene una de las tasas más altas de incidencia de 58.1 nuevos casos por cada 100,000 mujeres al año siendo responsable de la muerte de 2 a 4 mujeres cada día. Las lesiones precursoras que dan origen a cáncer cervical pueden ser irreversibles o mantenerse in situ por varios años antes del establecimiento del cáncer invasor.Así mismo evidencias identifican el rol etiológico del Virus Papiloma Humano (VPH) en el desarrollo del cáncer de cuello uterino y sus lesiones precursoras, concluyendo que el factor definitivo en la etiología de este cáncer es la infección persistente del cérvix por algunos genotipos de alto riesgo oncogénico de VPH. El diagnóstico oportuno de lesiones precursoras y del cáncer cervical basado en el examen ginecológico, incluye el estudio citológico, colposcopico e histopatológico. En la actualidad se incorporó a esta estrategia métodos moleculares dirigidos específicamente a la detección del ADN viral, que además permiten con elevada sensibilidad y especificidad la identificación genética de virus relacionados con alto riesgo oncogénico. De acuerdo con esto, el presente trabajo tuvo como objetivo implementar, desarrollar y evaluar el uso de procedimientos moleculares para el diagnóstico de VPH mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y valorar su aplicación en muestras cervicales de cáncer cérvico uterino y lesiones intraepiteliales precursoras, con la finalidad de contribuir al desarrollo de tecnología para la detección temprana y precoz del cáncer cervical en nuestro medio. La primera etapa del desarrollo de la PCR, incluyó la optimización de un protocolo de extracción de genoma viral. La segunda etapa incluyó el desarrollo del proceso de amplificación, para lo cual se utilizó como sustrato genético la línea celular SiHa. Se utilizaron los iniciadores de consenso MY09/MY11, que permiten la amplificación de un fragmento de ADN viral de 450 pb presente en una región conservada del gen de expresión tardía L1 presente en todos los VPH, la identificación del producto se realizó mediante revelado por electroforesis en gel de agarosa. Establecido el diagnóstico molecular del VPH mediante PCR, se llevó a cabo la detección de infección en muestras cervicales. Se trabajó con muestras celulares cervicouterinas de un total de 93 pacientes participantes de consulta colposcopica, clasificadas en cuatro grupos en función a su diagnóstico histopatológico. En nuestro estudio determinamos una frecuencia de 49por ciento (n=46/93) de casos positivos de infección por VPH mediante detección de ADN/VPH. Se encontró una distribución de las muestras positivas en los diferentes estadios clínicos de la siguiente manera: 9/21 de citologías normales (43por ciento); 16/47 lesiones de bajo grado (34por ciento); 16/20 lesiones de alto grado (80por ciento) y 5/5 cáncer invasor (100por ciento), observándose una clara tendencia de mayor positividad a infección por VPH según avanza el grado de lesión, lo que apoya la participación de este virus en el desarrollo de cáncer cervical. Se pudo evidenciar una tendencia de mayor número de casos positivos de infección por VPH en pacientes que tuvieron mayor número de parejas sexuales, lo que concuerda con diversos estudios epidemiológicos que indican que el riesgo de cáncer cervical está fuertemente influenciado por factores relacionados con ciertas conductas sexuales como el número de parejas sexuales, edad de inicio de vida sexual activa y la conducta sexual de la pareja. Al evaluar la frecuencia de casos positivos de VPH en relación al número de partos se puede evidenciar que existe una relación proporcional donde los casos positivos se incrementan en las mujeres con más de 1 parto. Una tercera etapa del estudio incluyó la tipificación de dos genotipos de alto riego oncogénico muy frecuentes a nivel mundial y responsables de la mayoría de las neoplasias cervicales: VPH-16 y VPH-18. Se tipificaron 17 muestras ADN/VPH positivas, 2 con metaplasiaepidermoide, 10 casos con lesiones intraepiteliales de alto grado (LIE-AG) y 5 con diagnóstico de cáncer invasor. Los resultados obtenidos mostraron una frecuencia de infección por VPH-16 en el 100por ciento (n=17) de las muestras tipificadas, 53por ciento (n=9) de infección por VPH-18, por lo tanto con estos valores 53por ciento de coinfecciones VPH16/VPH18. La frecuencia de infección de estos genotipos de alto riesgo oncogénico en función al diagnóstico cito-histopatológico de las pacientes fue de 100por ciento de infección por VPH-16 en los tres grupos con diferente estadio clínico, es decir que este genotipo se hizo presente en las 17 muestras analizadas. Por otro lado VPH-18 fue encontrado en menor frecuencia en casos de lesión más avanzada. De acuerdo a estos resultados se logró desarrollar la técnica molecular PCR para el diagnóstico de VPH, valorar su aplicación en muestras cervicales de cáncer cérvico uterino y lesiones intraepiteliales precursoras y finalmente la identificación de la frecuencia de los genotipos de alto riesgo oncogénico de mayor incidencia VPH-16 y VPH-18.