Optimización del MTT como método de cuantificación de la proliferación celular de esplenocitos murinos.

Abstract

La inmunidad de tipo celular constituye un mecanismo fundamental para la defensa del organismo. Esta respuesta, mediada por linfocitos T, es esencial para la protección contra patógenos intracelulares, como por ejemplo infecciones por parásitos intracelulares como es el caso de la leishmaniasis, toxoplasmosis, etc. Es por eso que se han desarrollado pruebas inmunológicas que permiten evaluar su funcionalidad, siendo la proliferación de linfocitos in vitro inducida por mitógenos, una prueba ampliamente utilizada. En la actualidad en nuestro medio, el Instituto de Investigaciones Fármaco-Bioquímicas (IIFB), de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas de la Universidad Mayor de San Andrés (UMSA), forma parte de un equipo multidisciplinario internacional que está llevando adelante estudios sobre la eficacia de formulaciones farmacéuticas a base de los principios activos de Evanta, frente a la leishmaniasis cutánea y continua en sus trabajos de investigación junto con el Instituto SELADIS (Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas-UMSA) sobre nuevas alternativas para el tratamiento de la leishmaniasis a partir de extractos vegetales. En el presente trabajo se optimizó el método del MTT para evaluación del efecto del Extracto de Alcaloides de Evanta (EAE) sobre la proliferación inducida por Lipopolisacárido (LPS) y Concanavalina A (Con A) en sistemas de cultivo celular primario (esplenocitos murinos) y a la vez se evaluó el efecto sobre la producción de interferón gamma detectable en los sobrenadantes de los cultivos inducidos con Concanavalina A. Se obtuvieron curvas de proliferación celular similares al inducir la proliferación con Con A y LPS, logrando determinar una concentración celular óptima para las pruebas siguientes, basándonos en la proliferación observada con controles de crecimiento sin mitógenos y con Tamoxifén como control de inhibición de proliferación. Al someter las células a distintas concentraciones del Extracto de Alcaloides de Evanta (EAE) se observó un efecto dosis-dependiente con una reducción de la proliferación celular de 35 % para una concentración de 10 µg/mL de evanta. Las células respondieron menos a la estimulación de Con A, comparados con el control no tratado y con el control de inhibición de la proliferación (tamoxifén). Los porcentajes de inhibición del crecimiento celular obtenidos fueron de 16%, 35% y 78% a concentraciones de 1, 10 y 25 µg/mL respectivamente. La inhibición de la producción de IFN-γ en los cultivos de esplenocitos murinos inducidos con Con A, es notable a partir de 1 µg/mL, estando más marcada a partir de 10 µg/mL. Se logró optimizar la técnica del MTT como método de cuantificación de proliferación celular en esplenocitos murinos, lo que nos permitió identificar la concentración celular óptima recomendable para los siguientes experimentos. Observamos un efecto inhibitorio de la proliferación (Porcentaje de inhibición = 35% para 10 µg/mL) proporcional a la concentración del EAE, por lo que podemos decir que afecta la funcionalidad celular a partir de 10 ug/mL. Por lo tanto los resultados muestran un efecto específico inhibitorio del EAE sobre células T, afectando principalmente su funcionalidad; hecho evidenciado con el porcentaje de inhibición alto en cultivos inducidos por Con A y sobre la producción de Interferón gamma (INF-ɣ).