Desarrollo y validación de un sistema de "ELISA casero" basado en la expresión de la proteína recombinante VP6 en E. coli, para el diagnóstico de Rotavirus del grupo A y sus potenciales aplicaciones

Abstract

Rotavirus del grupo A (RVA) es el agente causal más importante de enfermedad diarreica aguda (EDA) en niños menores de 5 años y en crías de mamíferos domésticos. El diagnóstico de RVA es importante para identificar a este patógeno, conocer su epidemiología y considerar medidas de control. Los métodos inmunológicos de detección de RVA están generalmente basados en la proteína VP6, la más abundante y conservada en el virión. En este estudio se reporta el desarrollo de un ensayo de “ELISA casero” para la detección de RVA, para el mismo se expresó la proteína recombinante VP6 de rotavirus humano en células de E. coli. Se utilizó a la proteína de fusión SUMO-rVP6, para incrementar la solubilidad. Una vez purificada y separada del péptido SUMO por clivaje proteolítico, la proteína se inóculo a conejos para la producción de anticuerpos policlonales IgG anti-rVP6, los cuales se utilizaron en un sistema de ELISA-sándwich para la captura y detección del antígeno viral. Para la validación de este ensayo, 181 muestras fueron analizadas mediante el ensayo de “ELISA casero” y los resultados comparados con un ELISA comercial recomendado por la OMS obteniéndose una sensibilidad diagnóstica de 93.42%, especificidad diagnóstica de 95.24% y un estadístico kappa de 0.887, interpretable como fuertemente concordante. Comparado con RT-PCR, el ensayo de “ELISA casero” obtuvo una sensibilidad de 89.45%, especificidad de 92.47% y un valor kappa de 0.781, estos valores fueron ligeramente mayores a los obtenidos por el ELISA comercial. El método desarrollado alcanza un nivel de sensibilidad de detección de hasta 3x103 CCID50. La especificidad analítica del ensayo fue evaluada frente a diferentes patógenos gastrointestinales: Giardia lamblia, ETEC, EPEC, EAEC, EHEC, Salmonella spp., Shigella, Norovirus, Coronavirus, Adenovirus, Parvovirus, C. perfringens, no observándose reaccion cruzada. Este ensayo permitió identificar a RVA perteneciente a diferentes genotipos (G2P[4], G3P[6], G9P[8], G9P[6], G12P[8], G1P[8]) circulantes en muestras de niños con GA. Asimismo, el ensayo se utilizó finalmente para la detección de un brote de EDA por RVA en camélidos domésticos. El “ELISA casero” desarrollado será de utilidad para la detección de RVA en la vigilancia de diarreas por rotavirus tanto en hospitales como también en los casos de diarrea en las unidades de producción ganadera.