Estudio molecular de especies de Leishmania y susceptibilidad In Vitro

Abstract

Introducción: En Bolivia, entre las enfermedades parasitarias más prevalentes están las producidas por Leishmania, está presente al menos en siete departamentos del país. Hoy en día, la identificación y caracterización de las diferentes especies de Leishmania es dificultosa debido a la plasticidad del genoma del parásito. En el presente trabajo, con el respaldo de la carta de intenciones entre el IIFB e INLASA, se describe y discute acerca de la amplificación y restricción enzimática del gen de la HSP70 de 51 cepas nativas de Leishmania y 2 cepas de referencia, para su tipificación molecular, además se trabajó evaluando la susceptibilidad in vitro de cada una de las cepas frente a Anfotericina B, Miltefosina, CAT y se determinó las concentraciones inhibitorias (CI50). Metodología: Se mantuvieron cultivos celulares de parásitos de 51 cepas nativas y 2 cepas de referencia, por una parte, se extrajo material genético de cada cepa y se procedió con la amplificación del gen de la HSP70, utilizando la PCR; una vez obtenido el amplicon se procedió con la restricción enzimática con la enzima HAEIII, los perfiles se observaron en gel de agarosa al 2%. Por otro lado se elaboraron placas de susceptibilidad de 96 pozos, donde se enfrentaron las cepas frente a Anfotericina B, Miltefosina y CAT (Alcaloides totales de Galipea longiflora), luego de 72 horas de incubación las placas fueron reveladas con el método colorimétrico XTT-PMS, de esta forma se obtuvieron los valores de CI50. Resultados: La tipificación molecular, permitió identificar zonas donde están distribuidas las diferentes especies; Leishmania amazonensis está presente sobre todo en la zona de Cajuata (10 cepas), Leishmania braziliensis se encuentra distribuida por diferentes regiones del Norte de La Paz y con respecto a las cepas identificadas como Leishmania lainsoni no se puede hacer una distribución ya que la cantidad de muestras es reducida. En cuanto a la susceptibilidad in vitro, cuando tratamos las cepas de Leishmania amazonensis y leishmania braziliensis con Anfotericina B se vio que estas son en su mayoría sensibles a esta droga, sin embargo, las cepas identificadas como Leishmania braziliensis tienen valores de CI50 frente a Miltefosina muy variables, siendo el mínimo de 0,5±0 µg/mL y el máximo de 23,8±0,14 µg/mL. Al tratar las cepas con los alcaloides totales de Galipea longiflora se vio que gran parte de las cepas (sin importar especie) son muy sensibles a esta droga. Conclusiones: Se pudo demostrar la posibilidad de detectar al gen de la HSP70 mediante PCR de 51 cepas nativas y de 2 cepas de referencia; se pudo confirmar la presencia de 3 especies de Leishmania en el Norte de La Paz: L. amazonensis, L. braziliensis, L. lainsoni; El método colorimétrico permitió identificar aquellas cepas que muestran valores de CI50 poco alentadores y también aquellas con resultados favorables; Finalmente se pudo elaborar mapas con los datos de la identificación y la distribución geográfica de un total de 98 cepas nativas según la especie estudiadas entre el IIFB y el laboratorio de Parasitología del INLASA entre los años 2009-12, también se pudo incluir en los mapas aquellas cepas con resultados poco alentadores en la prueba de susceptibilidad y origen.